Investigación estructural y dinámica de la histona H2B en pozo.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 672 (2023) Citar este artículo

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El dímero H2A-H2B es un componente clave de los nucleosomas y un actor importante en la biología de la cromatina. Aquí, caracterizamos la estructura y dinámica del H2B en partículas del núcleo del nucleosoma (NCP) precipitadas con una concentración fisiológicamente relevante utilizando RMN de estado sólido. Nuestra reciente investigación del tetrámero H3-H4 determinó sus propiedades dinámicas únicas y el presente trabajo proporciona una comprensión más profunda de las redes dinámicas observadas previamente en NCP que es potencialmente funcionalmente significativa. Se obtuvieron asignaciones de 13C, 15N casi completas para H2B R30-A121, lo que permite extraer una dinámica estructural detallada y específica del sitio de aminoácidos sin precedentes. La estructura derivada del H2B en la muestra de NCP bien hidratada concuerda bien con la de los cristales de rayos X. La dinámica en diferentes escalas de tiempo se determinó de forma semicuantitativa para H2B de manera específica para el sitio. En particular, se observa una dinámica más alta de milisegundos-microsegundos para las regiones centrales de H2B, incluidas α1 parcial, L1, α2 parcial y L3 parcial. El análisis de estas regiones en el contexto de la estructura terciaria revela la agrupación de residuos dinámicos. En general, este trabajo llena un vacío para una asignación de resonancia completa de las cuatro histonas en los nucleosomas y delinea que las redes dinámicas en NCP se extienden hasta H2B, lo que sugiere un mecanismo potencial para acoplar el núcleo de histona con ADN distante para modular las actividades del ADN.

La partícula central del nucleosoma (NCP) en forma de disco sirve como unidad básica de la cromatina y está organizada por el ADN envuelto alrededor de un octámero de histonas que es un complejo de proteínas histonas H2A, H2B, H3 y H41,2,3,4. que está conectado por un conector de ADN para formar cromatina. El octámero de histonas proporciona una plataforma estable y, mientras tanto, preserva la plasticidad para respaldar la regulación del ADN. La modulación de las actividades del ADN se logra mediante diversos mecanismos que incluyen modificaciones postraduccionales (PTM)5,6,7,8, incorporación de variantes de histonas9,10 e interacciones con proteínas efectoras11,12. Con los recientes avances en las técnicas de biología estructural, se han resuelto recientemente estructuras sustanciales de resolución atómica de nucleosomas y complejos nucleosoma-proteína, lo que amplía nuestra comprensión de la regulación genética1,13,14,15,16. Además, la dinámica de los nucleosomas y subnucleosomas ha sido reconocida como esencial para la biología de la cromatina17,18,19,20. La cromatina es un sistema altamente dinámico tanto a nivel de microescala como de mesoescala, que está bien modulado por los factores de regulación para mantener la homeostasis celular17,19. Estudios recientes de RMN, MD y FRET han informado dinámicas a microescala con alta resolución espacial y temporal para nucleosomas18,21,22,23,24,25,26,27, revelando características dinámicas funcionales de histonas y ADN en los complejos. Además, los fenómenos de separación de fases se han investigado para la cromatina durante muchas décadas28,29,30, y recientemente los comportamientos de separación de fases líquido-líquido de la cromatina atrajeron mucha atención, ya que potencialmente describen nuevos mecanismos de regulación del ADN, aunque los resultados in vivo e in vitro son controvertidos. Se han obtenido datos para esta propiedad biofísica31,32,33, en espera de más investigaciones. La RMN de estado sólido (SSNMR) ha surgido recientemente como una de las técnicas de alta resolución capaz de dilucidar la dinámica y el ensamblaje conformacional en la biología de la cromatina22,34,35,36,37. Por ejemplo, el estudio SSNMR de conjuntos de nucleosomas que albergan la monometilación de histona H4 aa K20 (H4K20me1) revela que este PTM mejora la dinámica de las histonas y reduce la compactación de los conjuntos de nucleosomas, lo que explica su abundancia en las regiones activas de transcripción38. Nuestra investigación previa de la dinámica de los nucleosomas aclaró la existencia de redes dinámicas en el tetrámero H3-H4 formado por varios residuos39. Esas redes permiten el acoplamiento entre las regiones centrales de las histonas con el ADN y pueden transmitir señales epigenéticas desde las regiones centrales a los sitios lejanos del ADN. Un estudio de MD informó recientemente sobre una dinámica funcional similar de los nucleosomas que realizó una simulación de 15 microsegundos de un NCP23. La existencia de redes dinámicas también es sugerida por un estudio de RMN en estado de solución de NCP que albergan sitios de acetilación en las colas N H3 y H440. Sin embargo, el dímero H2A-H2B es otro componente clave en la biología de la cromatina, y aún falta una imagen completa de sus propiedades dinámicas en el núcleo del nucleosoma. El descubrimiento de las propiedades dinámicas funcionales del tetrámero H3-H4 en los nucleosomas nos anima a caracterizar aún más las histonas H2A y H2B en el núcleo del octámero de histonas del nucleosoma, lo que proporcionará información faltante sobre la dinámica funcional de los nucleosomas.

En el presente trabajo, implementamos SSNMR para investigar la estructura y dinámica de la proteína H2B en NCP bien hidratadas precipitadas de la solución. La muestra de NCP está altamente hidratada con una concentración de aproximadamente 370 mg/ml que corresponde a condiciones fisiológicas y está dentro del rango de concentración de cromatina in vivo (50 a 500 mg/ml)41,42. Se obtuvieron asignaciones multidimensionales de 13C y 15N para todos los residuos R30-A121 que se observan en los experimentos dipolares. La estructura secundaria derivada del dominio globular de H2B en el sedimento de nucleosoma bien hidratado es consistente con la estructura XRD del NCP cristalizado. El perfil CANCO sugiere una dinámica semicuantificada del núcleo H2B en una escala de tiempo de milisegundos-microsegundos, lo que infiere que una de las regiones dinámicas está cerca de los dominios dinámicos H4 y otro grupo está cerca del ADN. Los resultados sugieren que las redes dinámicas también se extienden al H2B en el NCP, lo que puede ser potencialmente crítico en la modulación de las actividades del ADN.

Se reconstituyó una muestra de NCP a partir del ADN43 Widom 601 de 145 pb y el HO que contenía H2B marcado uniformemente con 13C y 15N. La muestra de NCP se sedimentó con Mg2+ 20 mM, lo que dio como resultado un grado máximo de precipitación y una estructura de apilamiento hexagonal columnar44. El contenido de agua de la muestra SSNMR fue del 67%, el cual se determinó utilizando las integrales de la señal de H2O y la señal de proteína en un espectro 1H SSNMR, correspondiente a una concentración de NCP de 370 mg/ml que se encuentra dentro del rango de concentración de cromatina fisiológica41. 42. La calidad de la muestra de NCP se evaluó primero mediante experimentos de resonancia rotacional asistida dipolar (DARR) unidimensional (1D) 1H-13C CP y bidimensional (2D) 13C-13C45. Se obtuvo una alta resolución de los datos SSNMR, como lo representa el espectro que se muestra en la Fig. 1, que tiene una calidad similar a la de nuestros estudios recientes de los NCP que albergan H3 o H422,46 uniformemente etiquetados. Se recolectaron DARR 2D, NCA, NCO, NcaCX, reacoplamiento dipolar mejorado por modulación de amplitud (DREAM)47, NCACX, NCOCX y CANCO tridimensionales (3D) para realizar primero las asignaciones de desplazamiento químico para residuos en el dominio globular de H2B en el PNC. La alta calidad de los espectros SSNMR nos permite realizar una caminata secuencial de la columna vertebral para el H2B como se muestra en la Fig. S1. En general, se obtienen asignaciones de resonancia 13C, 15N casi completas para R30-A121 utilizando los datos SSNMR basados en dipolares. Los otros residuos en las colas N de H2B están ausentes en los espectros SSNMR basados en dipolares debido a su alta flexibilidad, que puede detectarse en los experimentos SSNMR INEPT basados en J (Fig. S2). La gráfica esquemática de los giros asignados se muestra en la Fig. S3, y las asignaciones se depositan en la base de datos BioMagResBank (número de acceso 51820). Este trabajo llena el vacío de asignaciones de resonancia de proteínas histonas en nucleosomas, junto con nuestra caracterización previa de H346 y H422, y otro trabajo de H2A realizado por Xiang y colaboradores34, que en conjunto proporciona asignaciones de resonancia SSNMR para las cuatro proteínas histonas en la partícula central del nucleosoma. . Cabe señalar que las asignaciones obtenidas de H2B son para histonas de Xenopus laevis en este trabajo, las de H346 y H422 son para histonas de Homo sapiens y las de H2A son para Drosophila melanogaster en el estudio anterior34. Dados los altos niveles de conservación de las histonas centrales en todas las especies, las asignaciones de desplazamiento químico obtenidas para las cuatro histonas nos permiten acceder a información molecular mediante RMN en la mayoría de los escenarios. La disponibilidad de asignaciones de resonancia para proteínas histonas en NCP permite el uso de RMN en estado sólido y en solución para investigar las conformaciones de proteínas histonas en nucleosomas y complejos nucleosoma-proteína, y proporciona picos característicos para extraer la dinámica específica del sitio de aminoácidos.

Espectro DARR 2D 13C-13C de H2B en el NCP precipitado con Mg2+. Las asignaciones de picos parciales representativas están etiquetadas. En la recopilación de datos se utilizó un tiempo de mezcla DARR de 100 ms.

La estructura secundaria del H2B en esta muestra de NCP se obtiene fácilmente a partir de las asignaciones de desplazamiento químico. Aquí, utilizamos TALOS-N48 para predecir la estructura secundaria de H2B en la muestra de sedimento de NCP bien hidratada y el resultado se muestra en la Fig. 2. Se observan cuatro dominios de hélice unidos por tres bucles para los sitios de aminoácidos R30-A121. Además, existen estructuras cortas de lámina beta en los bucles L1 y L3. Esas estructuras secundarias derivadas concuerdan perfectamente con los datos XRD1,4. Los residuos A1-T29 y K122 están ausentes en los espectros de RMN de estado sólido de base dipolar, lo que sugiere que son altamente dinámicos en comparación con el dominio globular de H2B, lo que es consistente con las estructuras de bobina aleatoria. En general, la información estructural obtenida por nuestra medición SSNMR actual para el H2B en esta muestra de NCP bien hidratada es consistente con las estructuras XRD.

una predicción TALOS-N para H2B en NCP, la secuencia primaria de H2B R30-K122 se muestra en la parte superior. b Ilustración esquemática de la estructura secundaria de H2B determinada por el método XRD (PDB: 3lz04).

Las asignaciones de resonancia completas del dominio globular de H2B permiten la extracción de las fuerzas de acoplamiento dipolar específicas del sitio de aminoácidos a partir de experimentos de correlación de desplazamiento químico dipolar 3D (DIPSHIFT)49, de los cuales una de las dimensiones es la trayectoria de desfase dipolar y las otras dos dimensiones son el plano NCA para resolver sitios de aminoácidos individuales. Las constantes de acoplamiento dipolar promediadas en movimiento de 1H-13C y 1H-15N se calcularon ajustando las formas de líneas dipolares experimentales con datos simulados. Los parámetros de orden calculados para los residuos entre R30-A121 que se pueden resolver en el espectro NCA se presentan en la Fig. 3. Los valores de los parámetros de orden de los vectores de la columna vertebral (CH)α y NH se encuentran en el rango de 0,8-1,0 y fluctúan estrechamente entre residuos diferentes para los sitios en las cuatro regiones helicoidales y los bucles L1 y L2. Los residuos R30 y K31 pertenecen a la región de la cola N-terminal adyacente a la hélice α1, por lo que los parámetros de orden más pequeño son consistentes con la estructura altamente flexible de la cola N-terminal. De manera similar, los residuos T119 y A121 poseen parámetros de orden reducido, lo que refleja una mayor flexibilidad en la escala de tiempo de microsegundos-nanosegundos de T119-K122 que pertenecen a la región C-terminal corta y la hélice αC parcial adyacente. También se detectan valores más pequeños de los parámetros de orden para los residuos en el bucle L3, lo que muestra que este dominio exhibe una movilidad mejorada en la escala de tiempo de microsegundos-nanosegundos. Esto indica una mayor plasticidad del centro del núcleo de histonas en el NCP, donde la densidad de empaquetamiento es menor. En resumen, el estrecho rango de parámetros de orden determinados para la columna vertebral de la mayor parte del dominio globular de H2B en el NCP sugiere un empaquetamiento estructural rígido y apretado de los pliegues de histonas, que proporciona una plataforma estable para las actividades del ADN envuelto. Además, las regiones N-terminal y C-terminal, como se esperaba, exhiben una movilidad mejorada en la escala de tiempo de microsegundos-nanosegundos, y la región L3 muestra una mayor flexibilidad en comparación con la mayor parte del dominio globular.

a Parámetros de orden dipolar SNH y, b S(CH)α determinados para H2B en el NCP. En la parte superior se muestra la ilustración esquemática de la estructura secundaria del H2B. Las formas de línea experimentales y simuladas para todos los residuos se presentan en las Figs. S4 y S5. Las barras de error se calculan con intervalos de confianza del 95%.

Nuestros estudios previos de las proteínas H3 y H4 en el NCP demostraron la existencia de redes dinámicas en el núcleo de las histonas, formadas por residuos de aminoácidos que poseen mayor movilidad39. Esas redes conectan las regiones centrales de las histonas con sitios de ADN lejanos y pueden desempeñar funciones dominantes en la regulación de las actividades del ADN de una manera análoga a la regulación alostérica. Para revelar una imagen más completa de la dinámica en la escala de tiempo de milisegundos-microsegundos en el núcleo de histonas, aquí determinamos semicuantitativamente la movilidad de los residuos de aminoácidos H2B en el NCP. La figura 4 muestra los picos de intensidad de CANCO normalizados para residuos de H2B que pueden resolverse bien en los espectros 3D. El experimento CANCO basado en dipolar contiene dos pasos de transferencia de magnetización a través de interacciones de acoplamiento dipolar CN. En consecuencia, las intensidades de los picos espectrales reflejan principalmente la movilidad en la escala de tiempo de milisegundos-microsegundos. El perfil de intensidad de CANCO indica que algunas regiones poseen una movilidad relativamente mayor. Entre los residuos que se detectan en los experimentos dipolares, las regiones K31-E32, V45-H46 y P100-G101 están ausentes en el espectro CANCO, lo que ilustra su movilidad significativamente mayor en la escala de tiempo de milisegundos-microsegundos. Cabe señalar que R30-K31 y S120-A121 también están ausentes en los espectros CANCO, lo que también puede atribuirse a movimientos rápidos en submicrosegundos, como lo indican los parámetros de orden más pequeño obtenidos de las mediciones de acoplamiento dipolar. Además, el resto del dominio globular muestra considerables diferencias de intensidad máxima entre diferentes regiones, como se indica en la Fig. 4. Un reciente estudio de simulación MD de 15 microsegundos observó eventos de movimiento de microsegundos que ocurren tanto para las colas de histonas como para las regiones centrales de histonas, que gobiernan el desenvolvimiento del ADN23 . Por lo tanto, además de los movimientos rápidos de nanosegundos-microsegundos, las colas N-terminales de histonas probablemente estén involucradas en movimientos en la escala de tiempo de milisegundos-microsegundos. A continuación, resumimos los residuos de H2B que poseen una dinámica relativamente más alta y exploramos sus conexiones con la red dinámica observada previamente para las histonas H3 y H4 en NCP. En la Fig. 5, las regiones resaltadas en rojo y rosa corresponden a residuos que poseen la mayor flexibilidad (ausente en CANCO) y una dinámica de milisegundos-microsegundos relativamente mayor (que muestra una menor intensidad de CANCO). Las regiones en H2B que exhiben mayor movilidad incluyen principalmente la región N-terminal y las regiones parciales α1, L1, α2 y L3, así como el extremo C-terminal. Como se ilustra en la Fig. 5, la región N-terminal, las regiones α1 y L1 parciales, se agrupan y están en estrecho contacto con el ADN. Curiosamente, los residuos de la región α2 parcial con mayor flexibilidad están en las proximidades de la región H4 α3 que se determinó que exhibe una dinámica mejorada en nuestro trabajo anterior39. Esta agrupación de regiones con mayor movilidad sugiere que las redes dinámicas del tetrámero H3/H4 también se extienden al dímero H2B/H2A, aunque todavía no hay datos de dinámica cuantificados determinados para H2A. Dos regiones cortas adicionales que poseen mayor movilidad son la región L3 parcial y el extremo C-terminal, de los cuales la primera se ubica en el centro del núcleo de histona con baja densidad de empaquetamiento. La mayor dinámica de esas regiones probablemente corresponda a sus características estructurales de empaquetamiento.

Las alturas de los picos de CANCO se representan en función del número de residuos. Las alturas de los picos se normalizan al valor más alto del conjunto de datos. Las barras de error se calculan a partir de los valores RMSD del ruido espectral CANCO. Los puntos rojos indican residuos en el dominio globular H2B, de los cuales los picos CANCO entre residuos están ausentes en el espectro. Se dibuja una línea discontinua roja correspondiente a un valor del eje y de 0,5 para guiar la visualización.

Los residuos dinámicos correspondientes a aquellos que muestran señales de pico CANCO 3D nulas o más débiles (intensidad normalizada <0,5) se resaltan en rojo y rosa, respectivamente, en la estructura NCP. En la parte inferior se muestran imágenes ampliadas de dos regiones que contienen residuos dinámicos agrupados. En el panel inferior derecho, también se muestran las cadenas laterales de los residuos dinámicos en H2B α2 y H4 α3 para ilustrar sus contactos espaciales. Algunos residuos están marcados para ayudar a identificar las ubicaciones relativas de diferentes regiones.

La cromatina es un complejo ADN-proteína altamente dinámico con estructura y dinámica reguladas por varios factores. La dinámica de la cromatina tanto a nivel de microescala como de mesoescala es fundamental para sus funciones biológicas. Nuestros estudios anteriores y los de otros grupos sugirieron una relevancia funcional significativa de las escalas de tiempo de milisegundos a microsegundos en los nucleosomas y la existencia de redes dinámicas que potencialmente permiten el acoplamiento entre las regiones centrales de las histonas alejadas de los sitios del ADN, lo que potencialmente podría impulsar la transmisión de señales generadas por cambios como las modificaciones epigenéticas. En este trabajo, realizamos un estudio SSNMR para explorar la estructura y dinámica interna de la histona H2B en NCP con una concentración cercana a la fisiológica. Las asignaciones de desplazamiento químico de 13C, 15N obtenidas de H2B crean una base de datos completa para las asignaciones de desplazamiento químico disponible para las cuatro histonas en los nucleosomas. El H2B en este gránulo de NCP bien hidratado se pliega en la misma estructura determinada previamente mediante estudios de XRD. Los parámetros de orden derivados de las mediciones de la constante de acoplamiento dipolar y el perfil de intensidad máxima de CANCO brindan información sobre la dinámica en las escalas de tiempo de microsegundo-nanosegundo y milisegundo-microsegundo para H2B en NCP de una manera específica del sitio. La mayoría de los dominios globulares poseen una movilidad similar de microsegundos-nanosegundos, lo que infiere una región central de histonas estable y compacta. Se observó que varias regiones mostraban una dinámica relativamente mayor de milisegundos-microsegundos en el núcleo H2B, una de las cuales está en estrecho contacto con el ADN y las otras agrupadas junto con una de las redes dinámicas H3-H4. Esto ilustra que también existen redes dinámicas en los dímeros H2A-H2B y que potencialmente interactúan con las del tetrámero H3-H4 y con el ADN. Un estudio reciente ha informado los parámetros de orden predichos utilizando el método de índice de bobina aleatoria (RCI) para H2A en un NCP34; sin embargo, aún falta la determinación experimental de la dinámica de H2A. Se espera un estudio sobre la dinámica del H2A en diferentes escalas de tiempo para dilucidar la imagen completa de las redes dinámicas en el nucleosoma. En general, el trabajo actual proporciona una caracterización invaluable de la dinámica interna de las histonas en los nucleosomas y espectros de huellas dactilares clave para futuros estudios de cromatina por RMN.

Aún falta el último dato, que es la dinámica de H2A, para una comprensión más completa de la dinámica del núcleo de histonas en los nucleosomas. Además, la dinámica se obtuvo de forma semicuantitativa y sólo para los residuos del esqueleto de aminoácidos. Se pueden realizar experimentos futuros que empleen otras técnicas SSNMR50,51 o en combinación con simulaciones MD para dilucidar los movimientos de las cadenas laterales de aminoácidos y el ADN con una resolución espacial y temporal más alta, aunque tales experimentos son un desafío para estos complejos de gran tamaño. Además, explorar la relevancia funcional de las redes dinámicas observadas para el nucleosoma requiere más estudios biológicos paralelos similares a nuestro trabajo reciente38.

Las proteínas histonas fueron sobreexpresadas por la cepa pLysS de Escherichia coli BL 21 (DE3). El cultivo celular se cultivó en medio 2x YT a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,5 y luego se indujo con IPTG 0,4 mM. Las células se recogieron después de una incubación de 3 horas a 37 °C. Los cuerpos de inclusión se extrajeron y se disolvieron en tampón de despliegue que contenía HCl de guanidinio 7 M, acetato de sodio 20 mM (pH 5,2), DTT 10 mM (o DTT 20 mM usado para la preparación de H3). La solución de histonas crudas se purificó posteriormente usando una columna HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare) y las fracciones de elución se dializaron contra agua Milli-Q que contenía beta-mercaptoetanol 5 mM. Para fracciones de histonas que contienen contaminación de ADN, se realiza un segundo paso de purificación mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna RESOURCE S (Cytiva). Las proteínas purificadas se liofilizaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Para obtener Xenopus laevis H2B marcado isotópicamente con 13C y 15N, las células se cultivaron primero en medio YT 2x hasta que la DO alcanzó 0,5 y luego se centrifugaron a temperatura ambiente. Las células recolectadas se resuspendieron en medio M9 que contenía 2 g/l de 13C-glucosa y 1 g/l de 15N-NH4Cl y se incubaron a 37 °C durante una hora antes de la inducción con IPTG 0,4 mM.

Para preparar el octámero de histonas (HO), se disolvieron Xenopus laevis H2B liofilizado con 13C, 15N marcado y Homo sapiens H2A, H3 y H4 abundantes naturales en un tampón de despliegue que contenía HCl de guanidinio 7 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y 10 TDT mM (TDT 20 mM para H3). La solución de cuatro histonas diferentes se mezcló en una proporción equimolar. La mezcla se dializó contra el tampón de replegamiento que contenía NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA sódico 1 mM, beta-mecaptoetanol 5 mM a 4 °C. La solución de H2O obtenida se purificó mediante filtración en gel FPLC usando una columna HiLoad 16/60 Superdex de 200 pg (GE Healthcare). Las fracciones se evaluaron mediante gel SDS al 18% (Fig. S6) y el HO puro se combinó para la reconstitución posterior.

El ADN de Widom 601 de 145 pb se obtuvo mediante amplificación de un plásmido pUC19 que alberga ocho copias de los fragmentos de ADN con la cepa DH5α. Las células se cultivaron en medio TB y se recogieron después de 21 h de crecimiento a 37 °C. Los plásmidos se extrajeron mediante el método de lisis alcalina y se digirieron mediante EcoRV-HF (NEB). El ADN 601 de 145 pb se separó del vector principal mediante fraccionamiento con polietilenglicol.

La NCP se reconstituyó mediante el método de diálisis convencional en gradiente de sal52. El ADN y el HO que contenían H2B marcado uniformemente con 13C y 15N se mezclaron en un tampón de partida que contenía KCl 2 M, EDTA 1 mM y DTT 1 mM. La mezcla se transfirió a una bolsa de diálisis de 3 kDa y se colocó en el tampón inicial que se retira constantemente y se reemplaza por el tampón libre de KCl usando una bomba peristáltica durante 20-24 h a un caudal de 0,5 ml/min a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se dializó contra el tampón sin KCl durante otras 2-3 h para garantizar que la concentración de KCl alcanzara menos de 0,2 M. El producto reconstituido se evaluó con 6% de PAGE nativa y 18% de SDS-PAGE (Fig. S6).

La NCP reconstituida que contiene uniformemente H2B marcada con 13C y 15N se concentró a 3 mg/ml en un tampón que contenía Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, KCl <0,2 M (de diálisis en gradiente de sal) y se transfirió a un SSNMR. En un dispositivo de carga de muestras (Giotto tech), se añadió MgCl2 1 M a la solución de NCP hasta una concentración final de Mg2+ 20 mM para inducir la precipitación máxima de NCP. La muestra se centrifugó a 100.000 xg a 4 °C durante 2-3 h para hacer girar el sedimento de NCP hasta un rotor SSNMR de 3,2 mm.

Todos los experimentos SSNMR se realizaron en un espectrómetro Bruker Advance III HD de 18,8 T equipado con una sonda EFree de 3,2 mm. La velocidad de giro del ángulo mágico (MAS) fue de 15151 Hz y la temperatura se reguló con una unidad BCU-II para mantener la temperatura de la muestra a 12 °C, que se calibró usando etilenglicol53. Se realizaron 2D CC DARR con diferentes tiempos de mezcla, reacoplamiento dipolar 2D CC mejorado por el esquema DREAM, 2D NcaCX, 3D NCACX, NCOCX y CANCO para obtener asignaciones de 13C, 15N. Se realizaron experimentos 3D DIPSHIFT utilizando secuencias de simetría R1214,54,55 en el canal 1H en tiempo constante para extraer formas de líneas dipolares 1H-13C y 1H-15N. Los parámetros experimentales detallados se enumeran en la Tabla S1 de la Información complementaria. Los datos se procesaron utilizando NMRPipe56 y se analizaron con SPARKY (TD Goddard y DG Kneller, Universidad de California, San Francisco). Los desplazamientos químicos del 13C se hicieron referencia utilizando adamantina como estándar externo con la señal de carbono en el campo establecida en 40,48 ppm57, y la referencia del desplazamiento químico del 15N se calculó indirectamente. Las trayectorias de reacoplamiento dipolar 1H-13C y 1H-15N se extrajeron en NMRPipe y se ajustaron utilizando SIMPSON58.

Los experimentos 3D NCACX, NCOCX y CANCO se recopilaron de 10 a 16 veces y se agregaron conjuntamente para su análisis. Los experimentos 3D DIPSHIFT se realizaron entre 13 y 14 veces y se sumaron conjuntamente para el análisis. La desviación de las barras de error para los parámetros de orden mostrados en la Fig. 3 y los representados en la Fig. 4 se describen en los títulos de las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las asignaciones completas de turnos químicos obtenidas en este trabajo están disponibles en la base de datos de BioMagResBank con el número de acceso 51820. Los datos para realizar las Figs. 2, 3 y 4 están disponibles como Datos complementarios y cualquier información restante se puede obtener de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (para XS, número de subvención: 32201006), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Guangdong (para XS, número de subvención: 2021QN02Y103, 2022A0505030002), el Departamento de Educación de Guangdong Provincia (a XS, número de subvención: 2022ZDZX061). Una subvención de nivel 2 (MOE2018-T2-1-112) del Fondo de Investigación Académica del Ministerio de Educación de Singapur (AcRF) apoyó el trabajo en el laboratorio de LN. Todos los experimentos SSNMR se realizaron en el Centro de espectroscopia e imágenes de RMN de alto campo de la Universidad Tecnológica de Nanyang (NTU). También agradecemos al Instituto NTU de Biología Estructural NISB por apoyar esta investigación.

Chinmayi Prasanna

Dirección actual: Departamento de Fisiología y Biofísica, Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH, EE. UU.

Departamento de Biología, Universidad Shenzhen MSU-BIT, Shenzhen, Provincia de Guangdong, China

Xiangyan Shi

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Bhuvaneswari Kannaian, Chinmayi Prasanna, Aghil Soman y Lars Nordenskiöld

Instituto NTU de Biología Estructural, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Lars Nordenskiöld

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Conceptualización y diseño del estudio: XS y LN Adquisición y análisis de datos SSNMR: XS Preparación de muestras: BK, CP y AS Redacción y edición de manuscritos: XS y LN

Correspondencia a Xiangyan Shi o Lars Nordenskiöld.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Paul Schanda y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Joanna Timmins, Anam Akhtar y George Inglis.

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Reimpresiones y permisos

Shi, X., Kannaian, B., Prasanna, C. et al. Investigación estructural y dinámica de la histona H2B en partículas del núcleo de nucleosoma bien hidratadas mediante RMN de estado sólido. Común Biol 6, 672 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05050-3

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Recibido: 19 de febrero de 2023

Aceptado: 16 de junio de 2023

Publicado: 24 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05050-3

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